La medición
rutinaria de la masa celular es un problema no fácil de resolver. En el pasado
no se le consideraba como un problema para la optimización de la industria de
fermentaciones, pero actualmente existen mayores avances científicos que
permiten la cuantificación de la biomasa
Este método es
generalmente usado como referencia para otros métodos. La medición de peso seco da resultados fiables
cuando se trata de medios claros, en el caso de medios turbios u oleaginosos,
se requiere una centrifugación por gradiente y un cuidadoso lavado antes del
secado.
Aunque la
viscosidad no es directamente proporcional a la biomasa es un buen indicador
del crecimiento o de la lisis para organismos filamentosos, la medición de este
parámetro suele hacerce de forma manual ya que la medición de la viscosidad en
linea no suele ser estable en fermentaciones llevadas a cabo en pequeños
recipientes
Segun el tipo de
fluido existen diversos instrumentos para la medición de su viscosidad que se muestran en la siguiente tabla
|
Características
del fluido |
Tipo
de viscosimetro |
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Newtoniano |
Capilares De vidrio A presión variable Rotacionales De
cilindro coaxial Cónico y de plato Giro rotacional Caída de
esfera Orificio |
|
No-
newtoniano |
Capilares A presión variable Rotacionales De
cilindro coaxial Cónico y de plato |
|
Viscoelástico |
Rotacionales De
cilindro coaxial Cónico y de plato |
Este tipo de monitoreo
solo puede ser usado para medios claros y fermentaciones con organismos no
filamentosos ya que estos tienden a ensuciar las superficies ópticas con lo
cual dificultan el poder realizar un monitoreo automático.
Cuenta de celulas usando Hemocytometria
Una muestra es
colocada en un porta objetos especial el cual esta dividido en cuadrados de
área conocida, el numero de células presentes son contadas mediante observación
al microscopio.
Es usado para
determinar el numero de células, el tamaño de las células y las cantidades de
solidos de origen proteico disueltos. El rango cubierto por el contador Coulter
es de 0.4-56 mM. Esta técnica esta basada en una reducción de la conductividad
eléctrica cuando una partícula pasa atraves de un orificio, la reducción de la
conductividad es proporcional al tamaño de la partícula
Un método muy importante
para la detección de ATP esta basado en una técnica de bioluminiscencia que
utiliza una enzima - luciferasa - obtenida de la luciérnaga Americana (
Photinus pryalis ) ( Stannard y Gibs 1986 ), que cataliza la reacción de
conversión de luciferina a oxiluciferina
ATP +O2 +
D-Luciferina Oxiluciferina + CO2 + AMP + Pi + hv
|
Luciferasa |
A nivel
comercial existen disponibles en el mercado Kits que proveen tanto la enzima,
como el sustrato y los reactivos para extraer el ATP intracelular, la luz
generada en la reacción es medida en un fotómetro, y se relaciona de forma
directa con la concentración de ATP en
la muestra. Usando esta técnica es posible medir de forma bastante sensible y
rápida la presencia de ATP.
Como las células vivas contienen ATP pueden ser detectadas mediante la medición de este parámetro. Pudiendo usarse la técnica de bioluminiscencia para el monitoreo y aseguramiento de la limpieza tanto de equipos como de, superficies, con la ventaja de que los resultados son obtenidos en pocos minutos. Esta técnica también puede ser usada para la detección de contaminación microbiana en muestras liquidas, siendo los resultados obtenidos en pocas horas
Existe una
correlación directa entre el numero de unidades formadoras de colonias y la
concentración de ATP, aunque no suele ser muy precisa a bajos niveles de
contaminación microbiana
El NAD reducido
es detectado por sus propiedades de fluorescencia ( Beechey y Ribbons, 1972 ).
Estas pruebas se encuentran disponibles a nivel comercial y pueden ser
instaladas en un puerto estandar de un fermentador. Existe el problema de que
el NADH no puede ser correlacionado de forma directa con la biomasa ya que se
ve afectado tanto por el pH del medio como por el Oxigeno disuelto y las
limitaciones de sustrato, aun así bajo ciertas condiciones la correlación entre
NADH y biomasa suele ser buena ( Zabriskie, 1979; Beyeler, 1981).
La demanda
celular de Oxigeno es comúnmente usada para la medición de la actividad
metabólica de un cultivo. Se toma una muestra libre de burbujas esta es colocada en un agitador
temperatura controlada y
mediante la utilización de un sensor de Oxigeno disuelto se mide la tensión de
Oxigeno, esta medición es convertida por el mismo sensor a un valor de Oxigeno
transferido, este valor puede exceder la capacidad de transferencia de Oxigeno
del biorreactor.
La viabilidad
Celular es medida mediante la reducción del azul de metilo a un compuesto
incoloro ya que las células viables contienen enzimas que reducen al azul de
metilo, por su parte las celulas muertas son teñidas de color azul, por lo
tanto el porcentaje de células no teñidas es considerado como una medida de
viabilidad. La fiabilidad de esta prueba disminuye conforme la viabilidad de
las células decrece.