PRODUCCIÓN DE b-CAROTENO

OBJETIVOS.

General.

Obtener b-caroteno a partir de microorganismos aislados de verduras.

Particulares.

Aislamiento primario y secundario de una cepa microbiana capaz de producir b-caroteno.

Mantenimiento e identificación de una cepa microbiana con la facultad de producir b-caroteno.

Lograr la producción de b-caroteno en un matraz de prueba.

Realizar la cinética microbiana de la producción de b-caroteno de los microorganismos aislados.

Lograr el escalamiento en la producción de b-caroteno a fermentador

INTRODUCCIÓN.

Él b-caroteno es un pigmento anaranjado obscuro en las plantas, que al ingerirlo los animales pueden desdoblarlo a dos moléculas de vitamina A (retinol), se utiliza para enriquecer a los alimentos y es útil para la conservación y crecimiento de las células epiteliales de la piel, ojo, vías digestivas y aparato respiratorio. En adición, este es un buen antioxidante para daño a tejido o acción reductora a células, causado por el oxígeno reactivo y por moléculas fototóxicas. El b-caroteno es obtenido de frutas y verduras, también se puede obtener a partir de los microorganismos, un ejemplo de esto es Blakeslea trispora, el único inconveniente de la obtención de b-caroteno es que este se halla en la pared celular.

TRABAJO EXPERIMENTAL. ( ver diagrama 1)

Primera parte:

Se realizaron diluciones de 10-1, 10-2 y 10-3 para cada una de las muestras (zanahoria, pepino, tuna, queso y contaminación del equipo de celulasas)

Se sembró 0.1ml de la dilución en caja petri por técnica de extensión con varilla de vidrio, se utilizó medio PDA el cual se le bajo el pH con ácido tartárico a una concentración de 0.1%.

Después de 1 semana se resembraron varias colonias capaces de difundir color al medio, la resiembra se realizó en cajas petri por la técnica de estría cruzada usando PDA más ácido tartárico al 0.1%.

Segunda parte:

Para la identificación de carotenos se realizó la siguiente prueba colorimétrica:

1-2mg de muestra + 1ml de cloroformo + 5 gotas de H2SO4 conc.

Si la coloración en la interfase del cloroformo y del ácido es azul, la prueba es positiva, en la muestra hay carotenos.

Se sembró por punto 2 de las colonias previamente seleccionadas (ya que se tratan de hongos filamentosos), finalmente de estas resiembras se pasaron a tubos inclinados con PDA.

Tercera parte

Se realizaron varios microcultivos en PDA

Se preparo medio líquido para la selección secundaria, los componentes de este medio son:

Componente Concentración(g/l)

Almidón de maíz 50

Aceite de soja 30

Extracto de levadura 1

KH2PO4* 0.5

MnSO4* 0.2

*las sales se esterilizan por separado

Se inocularon matraces de 250ml del medio y se colocaron en agitación. Se realizaron observaciones al microscopio con la finalidad de identificar morfología microscópica de esta se encontraron una colonia de levaduras(rosa) y dos hongos filamentosos (morado y contaminación).

Pero tuvimos que cambiar la formulación del medio ya que era muy obscuro y resultaba difícil de leer en el espectro, el medio usado finalmente fue el siguiente

Componente	Concentración g/l
Glucosa	30
Extracto de levadura	2
Almidón	2
KH2PO4*	0.5
MnSO4*	0.2

Después de inocular este medio comenzamos a tomar muestra cada 48 hrs. ya que al tratarce de hongos y levaduras su metabolismo es mas lento, que el de las bacterias, pero cuando ya empezaba a haber producción de color, las muestras fueron contaminadas encontrando nosotros un dia el tapón sumergido en uno de los matraces, por lo que tuvimos que recomenzar la cinética, en este caso tomamos muestra cada 4 días, las muestras fueron congeladas,

Centrifugamos el total de las muestras a 1500 R.P.M. durante 30 min para obtener biomasa por peso húmedo, al sobrenadante se le realizo la prueba con DNS para obtener la concentración de glucosa, también se le midió el pH.

Se analizaron en el espectro de U.V las muestras comparándolas con un análisis echo a extracto de Zanahoria y posteriormente las analizamos en espectro de luz visible, para obtener la lamda máxima y corroborar que era B-caroteno

Diagrama 1

RESULTADOS.

A los tres días de siembra se observó el crecimiento de colonias levaduriformes blanquecinas de apariencia húmeda y borde liso.

A la semana de siembra se observó en aquellas realizadas a partir de las diluciones de pepino, colonias de levaduras y de hongos capaces de producir color y en algunos casos con la habilidad de difundirlo al medio, los colores de las colonias van del anaranjado al rojo.

Se resembraron aquellas que eran capaces de difundir el color al medio lográndose el aislamiento primario de varias cepas de m.o. capaces de producir color y con las siguientes características:

Cepa Morfología microscópica color Morfología colonial

1 Hongo filamentoso Morado Consistencia: dura

Apariencia: húmeda

Borde: rugoso

2 Hongo filamentoso Anaranjado Consistencia: suave

Apariencia: seca

Borde: rugoso

3 Levadura Rosa Consistencia: suave

Apariencia: húmeda

Borde: liso

Se colocaron los tres microorganismos en el medio liquido primeramente descrito, no se veía nada por la concentración del almidón y por el aceite de soja, en este medio el microorganismo morado vertía un color morado al medio y producía un solvente ya que al destapar el matraz de fermentación olía parecido a acetato de etilo, los otros dos microorganismos se desarrollaron muy poco en este medio y no vertieron algún color.

Después se colocaron en un medio con la variante de cambiar el almidón por glucosa ya que como dijimos en el primer medio, que por cierto era el reportado en la literatura para la producción de B- caroteno, no se podía ver nada, el aceite de soja también se cambio por extracto de levadura. para evitar los problemas al mezclarlo

Después de 1 semana ya se veía como dos de los microorganismos habían cambiado el color al medio, estos fueron la levadura y el hongo filamentoso morado, la levadura que en base al microcultivo se trata al parecer de rodotorula tenía un color rosa pálido (rosa) y el hongo morado cambio al medio a un color rosa como las fresas casi rojo carmín, pero ya no producía el solvente de forma tan evidente como al principio, el microorganismo anaranjado creció en forma de pellets de diversos tamaños pero sin producir color, después de 4 semanas los pellets empezaban a tener un color anaranjado, cabe mencionar que estos microorganismos fueron los únicos que tuvieron la prueba colorimétrica positiva, por que se observó en la interfase un anillo azul.

Pero como dijimos anteriormente realizamos un análisis en el espectro u.v. para corroborar que se trataba de B-caroteno y, los tres microorganismos poseen un compuesto similar, ya que las máximas fueron:

m.o. rosa	288
m.o- morado	289
m.o. contaminante	290

Luego al leer en la bibliografía encontramos que el B-caroteno en 489 tiene su lamda máxima, este valor se encuentra en el rango de la luz visible, así que realizamos un barrido en luz visible

lamda	Absorbancia
400	1.3232
425	1.2696
450	1.3544
475	1.4464
495	1.5344
500	1.5672
525	1.4792
550	1.4056
575	1.4056
600	1.112
625	1.124
650	1.1128

lamda	Absorbancia
400	1.303
425	1.249
450	1.334
475	1.431
495	1.434
500	1.445
505	1.485
525	1.41
550	1.354
575	1.268
600	1.214

Cepa	Morada	Rosa (Rodotorula)
Lamda maxima	500	505

Después de realizar la cinética obtuvimos los siguientes resultados

Biomasa (g) en 5 ml de muestra:

tiempo (Días)	morado	Rodotorula	Contaminación
0	0,35	0,2	0,1
4	0,45	0,3	0,4
9	1	0,7	0,6
12	2,5	1	1
18	3	1,5	1,5
22	3,2	1,7	2
26	3,1	1,6	2,5

Concentración de biomasa ( g/ml )

tiempo (Días)	morado	Rodotorula	Contaminación
0	0.07	0.04	0.02
4	0.09	0.06	0.08
9	0.20618	0.14	0.12
12	0.5	0.2	0.2
18	0.6	0.3	0.3
22	0.64	0.34	0.4
26	0.62	0.32	0.5

	Morado		Rodotorula
	Resultado de la regresión		Resultado de la regresión
Constante		-0,07014589	Constante	0,00827251
R cuadrado		0,90165162	R cuadrado	0,98642898
Coeficiente(s) X		0,0389945	Coeficiente(s) X	0,01552311

Cepa	V max. (g/ml*dia)	m max.(1/dia)	Yxs (g biom/ g sus)
Morado	0,0389945	0.14060314	37.5560172
Rodotorula	0,01552311	0.11377732	20.4610665

Cambio del pH

tiempo (Días)	morado	Rodotorula	Contaminación
0	4	4	4
4	4	3	3
9	3	2	2
12	3	2	2
18	2	2	2
22	2	2	2
26	2	2	1

Graficando:

Los valores de Absorbancia que obtuvimos después de leer a 550 las pruebas con DNS fueron los siguientes:

Tiempo (días)	morado	Rodotorula	Contaminación
4	0.593	0.57	0.591
8	0.543	0.523	0.556
12	0.363	0.412	0.448
18	0.354	0.374	0.34

En base a la ec abs=1.486e-2 +1.938e-3 [Glucosa (mg/ml)] calculamos la concentración de glucosa

Tiempo (días)	morado	Rodotorula	Contaminación
4	298.317853	286.449948	297.285862
8	272.51806	262.198142	279.226006
12	179.638803	204.922601	223.498452
18	174.99484	185.314757	167.770898

Después dividimos entre 10 para obtener g/l ya que las diluciones estaban a 100 que dividido entre 1000 para cambiar de mg a mg nos da un factor de corrección de 0.1

Tiempo (días)	morado	Rodotorula	Contaminación
0	30	30	30
4	29.8317853	28.6449948	29.7285862
8	27.251806	26.2198142	27.9226006
12	17.9638803	20.4922601	22.3498452
18	17.499484	18.5314757	16.7770898

Gratificando queda:

En base a los datos de lamda máxima leímos en el espectro los siguientes valores

Tiempo (días)	morado	Rodotorula
0	0	0
2	0.2704	0.115
4	0.508	0.243
8	1.3528	0.724
12	1.38	1.159
18	1.5672	1.485

nota: a falta de una curva tipo de b-caroteno no podemos saber cual es la concentración de B-caroteno en el medio, pero como la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de este metabolito, podemos muy bien utilizar estos datos para el análisis

CONCLUSIONES

Se pudieron aislar 3 cepas capaces de producir color, aunque en las pruebas colorimetricas para certificar que efectivamente se trataba de b-Caroteno, solamente una se vio como positiva, al realizar el análisis en el espectrofotometro en el rango de luz visible, ambas muestras tenían un pico de máxima absorbancia cercana al pico de b-Caroteno, la cepa morada en 500 y la cepa que pensamos es rodotorula en 505, basándonos en la bibliografía donde se reporta que el pico de máxima absorbancia del b-Caroteno se encuentra en 489 y su rango de color va del púrpura al anaranjado en las colonias productoras, cumplimos el primer objetivo de obtener cepas productoras de B-Caroteno

Las cepas tardan alrededor de cuatro días en empezar a producir colorante y alrededor de una semana para que empiecen a difundirlo al medio solido, esto coincide con lo esperado, porque aunque los b-Carotenos son considerados parte de los metabólitos primarios tardan en expresarse. En el medio liquido la cepa morada comenzó a producir color cuando habían pasado 58 hrs, la rosa después de 72 hrs y la anaranjada era el 28 dia y apenas comenzaban a colorearse los pellets, en la bibliografía se reporta que el beta caroteno se produce alrededor de las 56 hrs, lo cual se acerca mas al tiempo del mo morado, este también fue el que tuvo su pico de máxima absorbancia mas cercano al del beta caroteno.

Los Carotenoides actúan en las células como antioxidantes ante la acción de los rayos luminosos, de ahí que para aumentar su producción las cepas devén recibir la luz solar, por lo mismo las expusimos durante un tiempo a la luz solar, pero después de tres semanas empezaron a perder color, entonces decidimos alejarlas de la luz solar y al segundo dia nuevamente producían color y con mayor intensidad, estas cepas fueron las que utilizamos para correr la cinética.

En general el medio utilizado para la cinética fue el adecuado, solamente le cambiaríamos a la formulación la concentración inicial de glucosa y en vez de 30 g/L de glucosa adicionaríamos solamente 20 g/L ya que en la gráfica de glucosa vs tiempo vemos como al final de la cinética todavía quedaba poco mas de la mitad de la glucosa inicial, esto nos indica que al formular el medio consideramos como mayores los requerimiento de carbono y energía por parte de los m.o. y por lo tanto al final de la cinética todavía queda una parte de la glucosa, al disminuir la concentración inicial de glucosa en el medio formulado pretendemos evitar que esto ocurra nuevamente.

Al observar la gráfica de crecimiento microbiano vs tiempo y correlacionarla con la de Absorbancia, debida a la presencia de color, notamos que tanto la cepa morada como en rodotorula, la producción de color fue dependiente de la biomasa, esto coincide con lo esperado ya que el beta- caroteno se trata de un metabolito primario, en la contaminación no pudimos determinar muy bien esta característica ya que la cinética es muy larga

Después de correr la cinética y observar los resultados, seleccionamos a la cepa morada como la mejor, tanto por que sus parámetros cinéticos y de absorbancia fueron los mas cercanos a los esperados para la producción de B-caroteno, como porque es la que presenta un mejor rendimiento de biomasa y por lo mismo de B-caroteno ya que como dijimos anteriormente la producción de este metabolito es dependiente de la biomasa.

Para finalizar podemos decir que se cumplieron los objetivos planteados al principio, solo faltando el escalamiento a fermentador, el cual por falta de tiempo no se puede realizar ya que la cinética es muy tardada, en comparación con la de Rizobium que será realizada de forma demostrativa