Las proteasas alcalinas son enzimas capaces de hidrolizar proteínas en medios cuyo pH > > 7, por lo que son ideales para su utilización en detergentes , este tipo de enzimas son producidas por varias bacterias Gram + siendo el genero Bacillus el mas utilizado para la producción industrial , debido principalmente a su capacidad para excretarlas al medio de cultivo, de donde resulta fácil obtenerlas al evitarse el trabajo de tener que reventar las células para liberar la enzima.

Los dos tipos de proteasas presentes en mayor medida en cultivos de Bacillus son las proteasas alcalinas o serinproteasas, (debido a la presencia de serina en el sitio activo de la enzima), y las proteasas neutras o metaloproteasas. Por lo mismo las cepas de Bacillus subtilis pueden clasificarse en cuatro tipos según el tipo de proteasas que producen:

- El primer tipo: produce una gran cantidad de proteasas neutras, solo siendo capas de producir proteasas alcalinas después de mucho tiempo, desapareciendo gradualmente y en paralelo la producción de proteasas neutras, siendo por lo tanto baja la producción de proteasas alcalinas

- El segundo tipo: Produce ambos tipos de proteasas al mismo tiempo, pero la actividad enzimatica disminuye muy rápidamente debido al efecto que cada proteasa causa sobre la otra

- El tercer tipo: produce únicamente proteasas alcalinas

- El cuarto tipo: produce únicamente proteasas neutras

La alcalin-serin-proteasa excretada por Bacillus subtilis, también llamada subtilisin, es una de las enzimas mas estudiadas de ahí que sus genes hallan sido clonados repetidas veces, causándole diferentes delaciones para determinar su efecto, de estos estudios se ha podido determinar que subtilisin no se trata de una enzima esencial y que su ausencia no afecta ni el crecimiento ni la especulación de Bacillus, en general se puede decir que esto se cumple para todas las proteasas producidas por Bacillus. En la figura 1 se muestra el mapa genético de las proteasas alcalinas de B. subtilis , que como se observa se trata de un plasmido

Metabolismo de producción de la proteasa

La vía metabólica usada para la producción de proteasas es la misma que la usada para la producción del resto de las enzimas:

ADN ARNm Proteasa

Así que la forma general para inducir la producción de proteasas alcalinas es:

* Mantenimiento del medio de cultivo a un pH > 7

* Medio de cultivo con proteínas como única fuente de carbono para inducir la expresión de los genes encargados de la degradación de proteínas

* Evitar que el medio contenga glucosa u otras azucares ( o en caso de contener las concentraciones deben de ser muy bajas), ya que los genes de interés son susceptibles a represión catabólica.

Principio de acción

Como dijimos anteriormente las proteasas alcalinas hidrolizan los enlaces peptidico de las proteínas, con lo cual convierten una molécula grande- como lo es una proteína- en muchas moléculas de menor tamaño, facilitando con ello la formación de la esfera de solvetación en torno a ellas y por lo tanto su arrastre, lográndose que con menor cantidad de detergente sea retirada mayor cantidad de materia orgánica, con esta misma finalidad se agregan también lipasas a los detergentes

II ESTUDIO DE MERCADO

2.1 Mercado Nacional e internacional

En terminos generales todas aquellas compañias productoras de bio-detergentes son consumidores de enzimas tales como las proteasas y las lipasas alcalinas

2.2 Competidores

La unica empresa en el pais que produce proteasas alcalinas se encuentra ubicada en toluca

2.3 Producto en el mercado

Por las mismas caracteristicas del producto la forma de expendido hacia el mercado es obligatoriamente al mayoreo ya que en se trata de una materia prima para la industria de los detergentes mas que de un producto final de venta directa, por lo mismo las formas en la cual se podria adquirir es hasblando directamente a la empresa o mediante el uso de internet como le hacen algunas otras empresas internacionales que ofrecen este tipo de bioproductos

2.3.1 Presentaciones comerciales

Como se señalo con anterioridad solo podra adquirise al mayoreo por lo cual se expenderan en tambos de 50 kg c/u

2.3.2 Caracteristicas principales

Se trata de una enzima con las siguientes propiedades:

1) Acción: degradadora de proteínas y peptidos;

(2) pH optimo: valores de pH de 8.5 a 9;

(3) pH estabilidad: en rangos de pH de 5.5 a 10.5, las enzimas probaron ser completamente estables;

(4) temperatura optima: aproximadamente 50.°. C.;

2,3.3 Especificaciones

1) Se trata de un polvo blanco fino

2) Por su misma actividad deve de evitarse cualquier contacto directo con la piel

3) En caso de hacer contacto lavar inmediatamente con grandes cantidades de agua

2.4 Comercialización y Distribución

Se hara la comercializacion pricipalmente en base a la pagina web en internet, la guia amarilla y tambien de forma muy importante mandando folletos promocionales ha nuestros posibles consumidores es diecir a todas aquellas compañias productoras de detergentes, siendo una comercialización de tipo productor-empresario y de manera secundaria se utilizaria la comerzialización de productor-distribuidor- emprezario, la distribución seria principalmente por via terrestre en trailes equipados para poder atender a una contingencia en caso de que alguno de los tambos se derramase

III INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO

3.1 Materias primas

3.1.1 Cepa

Aislamiento Primario

Organismo

Habitad de donde aislarlo

pH optimo

Medio de cultivo y aislamiento primario

B. subtilis

Suelo, Agua

10.3-10.7

Agar nutritivo

B. alcalaphilus

Suelo enriquecido con pH 10

7.8-10

Parte A.- peptona 5; ext. de levadura 5;

KH2PO4 10 ; MgSO4 ·7H2O 0.2

H2O destilada 900ml

Parte B.-Na2CO3·10H2O 20;

H2O destilada 100ml

después de esterilizar A+B

PH final 10.5

B. licheniformis

Suelo

6.5-10

Agar nutritivo

B. firmus

Suelo

Agar nutritivo

Selección secundaria y mejoramiento de cepas

Como sabemos la selección secundaria se realiza con la finalidad de obtener aquellas cepas que cubran de manera mas amplia nuestras necesidades, en el caso de las proteasas alcalinas existen dos aspectos fundamentales que deben cubrir las cepas, para que puedan ser utilizadas industrialmente

1.- Que la enzima sea activa y estable en medios que contengan tenso activos

2.- Que el m.o. produzca suficiente proteasa como para poder ser explotado

Para cumplir lo anterior se ha utilizado diversos métodos que van desde aquellos puramente físicos, hasta la inserción de plasmidos y vectores de otras especies.

Por ejemplo : para lograr el aislamiento de cepas con la capacidad de producir enzimas con mayor estabilidad se suelen crecer aquellas cepas que presentaron capacidad proteolitica en medios que contienen como agentes de selección jabón o detergente, realizando de esta forma el aislamiento secundario de nuestra cepa.

Con este método se obtuvieron dos proteasas alcalinas de Bacillus pumilus DSM 5777 una alcalina Bacillus proteasa que presenta las siguientes propiedades:

(1) Acción: degradadora de proteínas y peptidos;

(2) pH optimo: valores de pH de 10.5 a 11.0 aproximadamente ;

(3)pH estabilidad: en rangos de pH de 9.7 a 10.8, las enzimas probaron ser completamente estables;

(4) temperatura optima: aproximadamente 60. °C.;

Y otra proteasa presento las siguientes propiedades

1) Acción: degradadora de proteínas y peptidos;

(2) pH optimo: valores de pH de 8.5 a 9;

(3) pH estabilidad: en rangos de pH de 5.5 a 10.5, las enzimas probaron ser completamente estables;

(4) temperatura optima: aproximadamente 50.°. C.

Por su importancia económica también se han enfocado esfuerzos para obtener cepas mutadas capaces de sobreproducir la enzima deseada, uno de tales esfuerzos fue realizado por J. P. Aubert, R Longin y Ston J. Millet quienes encontraron una cepa incapaz de esporular pero que posee la misma capacidad proteolítica que la cepa nativa, el método diseñado por ellos se basa en el echo de que las cepas de Bacillus subtilis que no esporulan no son resistentes a la exposición de los vapores del cloroformo, el método consistió en lo siguiente:

A) Primeramente las esporas de Bacillus subtilis son suspendidas por 10 minutos a 70° C , seguidamente son germinadas en medio Difco en presencia de cloranfenicol (100 mg/ml), el cultivo es incubado 48 horas a 39°C para finalmente ser tratado con N-metil-nitro-Nnitrosoguanadina (50 mg/ml) como agente mutagenico

B) Se sembró una serie en cajas petri con medio Difco

C) Se sembró otra serie la cual se expuso por 45 minutos a los vapores del cloroformo a temperatura ambiente

D) Ambas series son incubadas por 24 horas a 37°C

F) Se comparan los platos homólogos y se observa crecimiento

Después de medir actividad proteolítica los investigadores encontraron 3 cepas mutantes incapaces de esporular una de las cuales tenia la misma actividad proteolítica que la cepa original, esta cepa fue almacenada en el Instituto Pasteur en París con el numero de identificación 71-1-001

La importancia de esta cepa es que las proteasas alcalinas junto con otras enzimas que son secretadas al medio son producidas cuando el microorganismo se encuentra en la fase exponencial del crecimiento y empiezan a disminuir después de llegar a un máximo, lo cual sucede poco después de que el m.o. llega a su fase de crecimiento estable, después de la cual el m.o. comenzara a esporular por tanto de esta forma se induce a que el microorganismo se mantenga en la fase de producción de exoenzimas

Despues de investigar ampliamente la literatura la cepa que resulto ser mas atractiva para nuestros propositos fue Bacillus pumilus DSM 5777 que da un rendimiento del 90%

Especie

Fuente de Carbono

Ys g/mol

Tiempo de generación

O2 p/cell*h

x 10 g

O2 p/generacion

x10 g

B. subtilis

Glucosa

81.3

45.5-68.7min

16.1-47.8

18.0-46.5

3.1.2 Medios de producción

Ingrediente

Concentración (g/l)

Medio A

Almidón hidrolizado

Aceite de Soya

Caseina

Na2HPO4

3.3

Medio B

Almidón hidrolizado

150

Lactosa

4.3

Aceite de semillas de algodón

Extracto de levadura

7.2

Proteína de soya

3.65

K2HPO4

4.3

MgSO4·7H2O

1,25

Trazas de metales

Medio C

Cebada

100

Aceite de soya

· para ajustar pH (9-10) Na2CO3

3.2 Método de fermentación

Uno de los métodos utilizados para la producción industrial de las proteasas alcalinas es el conocido como de alimentación semi-continua, esta alimentación de nutrientes y sales es regulada en función al pH que debe de ser estrictamente controlado para conseguir una mejor productividad y de la etapa en la cual se encuentre el desarrollo de la cinética microbiana, suministrándose nutriente solamente en la etapa de crecimiento exponencial que es en la que se producen la proteasas alcalinas y donde se observan los mayores rendimientos para la obtención de la misma, esta alimentación también debe de ser muy controlada ya que la concentración de glucosa en el caldo de cultivo no debe de exceder de 0.43 g/l pues de lo contrario la producción de nuestro metabolito de interés ( proteasa alcalinas) se ve disminuida al entrar en acción los sistemas de represión catabolica.

Otra sugerencia es que en vez de usar harina de soya se use sulfato de amonio como única fuente de nitrógeno, con la finalidad de eliminar olores desagradables causados por la presencia de compuestos orgánicos nitrogenados en el medio.

Este metodo de alimentación semi-continua resulta 50% mejor que el método de fermentación por lote

3.2 Diagrama de flujo del proceso

3.4 Legislación

Por las mismas características del producto no existe ni a nivel nacional ni a nivel internacional normatividad con respecto al mismo, pero a nivel general podemos decir que:

a) Por las condiciones extremas en las cuales es llevada a cabo la fermentación ph> 10, proteína como única fuente de carbono, T de 50 °C, no es necesario llevar a cabo la fermentación en condiciones estrictas de esterilidad ya que solamente crecerán en ese medio m.o. capaces de producir proteasas alcalinas termoestables, mientras para todas las demás clases de m.o. las condiciones de crecimiento son insostenibles

b) Las pruebas de actividad se llevan a cabo en medio que contienen caseina y productos tensoactivos típicos de los detergentes como el tri sulfato de amonio, en estas condiciones y a temperaturas de 25 a 70°C se determina la actividad de la enzima midiéndose la cantidad de proteína degradada en un tiempo estandar de 5min para lo cual se utilizan pruebas colorimetricas.

c) Los operarios en general deberán de vestir oberoles especiales y caretas, que impidan el contacto de las proteasas con la piel, estos no serán muy necesarios en la zona de fermentaciones, pero en las zonas de purificación, extracción y empaque serán obligatorias

d) Como medida de bioseguridad hacia el ambiente se tendrá instalado en estas zonas filtros de aire que se encarguen de filtrar el aire que es expulsado, pensando en lo mismo se tendrá presión negativa con la finalidad de evitar que las proteasas salgan y dañen el ambiente

e) Las aguas residuales serán tratadas para desnaturalizar las proteasas que puedan quedar en el agua y así evitar contaminar los afluentes

IV PRODUCCIÓN

4.1 Localización de la planta

Macrolocalización: Veracruz

Microlocalización: Córdoba

4.2 Distribución de la planta

4.3 Control de puntos críticos y efluentes

Punto critico

Parte del proceso

- Concentración de glucosa < 0.43 g/l

Preparación de medios

- Mantenimiento del pH en 10

Fermentación

- Mantenimiento de la temperatura a 60°C

Fermentación

- Concentración de glucosa < 0.43 g/l

Fermentación

- Concentración de proteasas < 2 U/l

Efluentes de desecho

4.4 Diseño y presentación comercial

4.4.1 Diseño del envase

El envase tendrá las siguientes características:

* Tambos de latón forrados de cartón

* Diámetro de la base de 50 cm

* 75 cm de Altura

4.4.2 Diseño del empaque

-Los tambos serán empacados en bolsas de plástico

- La tapa de los mismos se encontraran selladas con cinta plástica para evitar posibles derrames

4.4.3 Etiquetas

Las etiquetas contendran información tales como

- Características del producto

- Especificaciones del producto

- Pureza y Peso del producto al envasado

- Formulación del Detergente

La formulación típica de un detergente puede contener, en relación a su peso seco

1. Minimamente el 5% de su peso, siendo lo mas común de un 10 a un 50% de su peso , del surfactante o la mezcla de surfactantes

2.Por arriba del 40% en peso de base

3.Por arriba del 40% en peso de blanqueador, preferiblemente un perborante como perborato de sodio tetrahidratado o perborato de sodio monohidratado,

4.Por arriba de 3% en peso de proteasa

5.Constituyentes adicionales como ajustadores, etc., para hacer el 100% en peso.

4.5 Normas de calidad de la Empresa

4.5.1 Aplicadas a la materia prima

- Concentración de sacaridos < 0.43 g/ kg

- Se le harán pruebas de viabilidad a la cepa antes de inocular el bioreactor

- El agua utilizada en el proceso deberá de ser destilada

4.5.2 Aplicadas al proceso

- Se deberá tener sumo cuidado para evitar fugas de cualquier tipo

- El proceso será monitoreado de continuo mediante sensores acoplados a un sistema de control automatizado

- Las áreas de extracción y purificación contaran con presión negativa y filtro de aire que eviten que las proteasas puedan contaminar el exterior de la planta

4.5.3 Aplicadas al producto terminado

- Se almacenara en tambos sellados listos para su entrega

- El almacenamiento será en un lugar seco con temperatura y presión controlada

4.5.4 Aplicadas al personal

- El personal deberá portar equipo protector especial para evitar que su piel o vías mucosa tengan contacto con las proteasas ya que estas son enzimas altamente irritantes

- Por las mismas razones no se permitirá comer en el interior de la zona de producción

V CALIDAD

5.1 Servicios en el laboratorio de pruebas

- Tomas de electricidad que estén conectadas a la planta auxiliar

- Tomas de gas adaptadas para ser conectadas a mecheros

- Tomas de agua normal y destilada

- Temperatura controlada a 25 °C

- Humedad controlada

- Aire filtrado

- Sistema de presión negativa

5.2 Instrumentos básicos en el laboratorio de pruebas

- Campana de esterilidad

- Autoclave para esterilización en húmedo

- Horno para esterilizado en seco

- Horno para incubación de muestras

- Horno de microondas

- Centrifuga con control de temperaturas

- Espectrofotometro

- Plataformas de agitación

- Balanza analítica

- Fermentador de 5 litros

5.3 Materiales y reactivos en el laboratorio de pruebas

- Matraces y vasos de precipitados de diferentes capacidades

- Pinzas, tijeras, asas bacteriológicas, mecheros

- Plumones indelebles y cinta masking

- Cajas petri

- Probetas , gradillas, pipetas y pipeteros

- Diversos tubos de ensaye

- Agar bacteriológico, nutritivo y PDA

- Peptona de caseina y de soya

- Ácido sulfúrico, clorhídrico

- Todos los necesarios para realizar las pruebas colorimetricas

- Algodón, gasa , papel periódico y papel higiénico

5.4 Programa básico de mantenimiento de equipo e instrumentos

El mantenimiento continuo será de tal forma que dia con dia se mantenga en lo máximo posible las condiciones de sanitidad en la planta, lavándose y esterilizándose los bioreactores y las lineas de alimentación cada vez que sean desocupados

Se realizara mantenimiento preventivo , haciendo una revisión rotatoria de equipos cada semana, se procurara ir cambiando aquellas lineas que lleven en servicio mas de 5 años o de ser necesario antes si muestran signo de corrosión y desgaste.

Con lo anterior se pretende no tener que llegar a hacer mantenimiento de tipo correctivo ya que este a la larga resulta ser mas caro y poco funcional

5,5 Formas para el control de la calidad

Mediante el uso de sistemas computarizados y automatizados de control se llevara una bitácora dia a dia de como va avanzando la fermentación en los diferentes reactores y en los demás procesos, dicha bitácora será almacenada tanto en la memoria principal de la computadora como en disquets que servirán de respaldo

5.6 Programa de auditorias de calidad

Se realizaran histogramas donde se muestre la calidad del producto y del sistema fermentativo etapa por etapa para cada una de las fermentaciones para que en el caso de que alguna se salga de los limites de control tomar medidas.

VI SERVICIOS

6.1 Comunicación de los clientes

Esta será de forma directa o mediante el uso de internet o vía telefónica ya sea con el departamento de compras y ventas o con el encargado de relaciones publicas dependiendo del asunto a tratar

6.2 Diseño de la propaganda y la monografía

Este será realizado mediante los servicios de una compañía especializada en diseño gráfico lo mismo la monografía que contendra ademas del logotipo elegido las especificaciones del producto la forma de acción y sus ventajas para el uso industrial

6.3 Garantía de calidad

Después de realizar las pruebas de estabilidad se expenderá una garantía de calidad que abarque el tiempo en el cual la mitad de la actividad de la enzima se pierde por las condiciones en las cuales se encuentra sometida

6.4 Orden de compra

Esta será vía internet o mediante vía telefónica

REFERENCIAS

- " Bacillus subtilis and another Gram + bacteria " , Cap. 63 Proteasas Janice Pero, Alan Sloma 1993

- " Industrial Enzymes - Recent Advances " Noyes pp 216-226 ed 1977

- " The Prokaryotes " cap 76 The genus Bacillus-Nonmedical R. A. Slepecky, H. E. Hemphill pp. 1664-1671

- " Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook " Bernard Atkinson, Ferda Mavituna Ed. Stockton press 1987 pp 1147-1153

- "High production ol protease alkaline by B. licheniformis in a fed-batch fermentation using a synthetic medium" Weiying Mao, Renrui Pan, David Freedman Journal of industrial Microbiology, 11 (1992) pp. 1-6 Ed Elsevier

J.P. Euzéby : Dictionnaire de bactériologie vétérinaire

http://www-sv.cict.fr/bacterio/bacdico/bb/bacillus.html

PATN Patent Bibliographic Information

WKU Patent Number: 05346822

TTL Title of Invention: "Alkaline proteases from Bacillus pumilus"

Inventor Name:Vetter; Roman, Wilke; Detlef, Moeller; Bernhard, Mueller; Martina

CTY Inventor City: Burgdorf, Wennigsen, Hannover

CNT Inventor Country: DEX

http://www.nal.usda.gov/bic/Biotech_Patents/1994patents/05346822.html